2005年，周秀娜以模特的身份参加动漫节，获得亚军。2006年，出演喜剧片《打雀英雄传》；6月，出演喜剧片《新扎师妹3》；同年，出演情景喜剧《老冯日记》。2008年，出演警匪动作片《花花型警》；11月，出演由叶念琛执导的爱情喜剧片《绝代双娇》。

2009年6月，出演由阮世生执导的喜剧电影《矮仔多情》，在片中饰演投资基金天王蓝子杰的未婚妻珠珠；10月，出演喜剧电影《死神傻了》；11月，出演惊悚电影《关人7事》，在片中饰演便利店的女店员秀娜。

2010年3月，与吕慧仪、黎诺懿等合作主演惊悚电影《恶胎》，在片中饰演心术不正的女护士郭少芳；7月，与钟欣潼、黄圣依等合作出演运动喜剧电影《出水芙蓉》，在片中饰演魔鬼队成员马阅；8月，与郭富城、张静初、吴京等合作出演变异人动作电影《全城戒备》，在片中饰演为了赢得上位与出名的目的女主播优优；10月，与杨千嬅、林峰等合作出演喜剧电影《完美嫁衣》，在片中饰演Perfect Wedding的婚礼统筹师Flora；11月，与蒋璐霞、元华等合作主演恐怖电影《僵尸新战士》，在片中饰演与人类友好相处的僵尸一族阿斯。

2011年3月，与曾志伟、杜汶泽合作主演喜剧片《猛男滚死队》；7月，与傅颖、罗仲谦等合作主演爱情电影《热浪球爱战》，在片中饰演从小生活在贝浪湾的Sharon；9月，与杨爱瑾、沈志明等合作出演爱情电影《喜爱夜蒲》；10月，出演由王晶、叶念琛执导的恐怖电影《猛鬼爱情故事》；12月，与罗仲谦、沈志明等合作主演爱情电影《婚前试爱》，在片中饰演结婚前夕因意外目睹男友泽与好友在夜总会出来，而产生误会的打工女郎琪。

2012年1月，与萧敬腾、曾志伟、赵正平等合作主演爱情动作喜剧电影《杀手欧阳盆栽》，在片中饰演有着冷静头脑与理智的电脑高手娜娜；2月，与范逸臣、邓家佳等合作主演惊悚电影《夜店诡谈》，在片中饰演一对性感妖娆的姊妹花艾米与艾丽；7月，主演由林小鑫执导爱情电影《猎音师》，在片中饰演性感、妖娆，亦正亦邪的吸血鬼小叶；8月，与杨幂、刘恺威等合作出演爱情悬疑电影《Hold住爱》，在片中饰演陶小磊的前女友方檬。

2013年1月，与林家栋、曾国珲等合作主演爱情电影《纸月亮》；1月21日，与方力申、李曼等联袂主演的古装悬疑剧《唐朝浪漫英雄》播出，在剧中饰演波斯商人的女儿陶夭夭，这也是周秀娜首次出演内地电视剧；2月，与蓝正龙、谢君豪合作主演惊悚电影《电梯惊魂》，在片中饰演与院长儿子林飞相恋的医院护士白洁；2月10日，出演由周星驰执导的古装神话电影《西游·降魔篇》上映，在片中饰演教段小姐跳舞色诱玄奘的四煞；2月12日，与甄子丹、柯震东等合作出演的爱情电影《在一起》上映；2月24日，与郑嘉颖、韩雪等合作主演的年代剧《叶问》播出，在剧中饰演大杂院包租婆的女儿珍妮；2月25日，与AEG新亚洲娱乐签约；8月，与方力申、张馨予等合作主演爱情冒险电影《致命闪玩》，在片中饰演阿德的前女友Mina；9月，与杜汶泽、邹凯光等合作主演喜剧电影《烂滚夫斗烂滚妻》；9月22日，一直关注慈善事业的周秀娜，在电影《我想结婚的时候你在哪》的开机新闻发布会上，获颁“最美心灵艺术家奖”；10月，与李灿森、孙祖杨等合作主演惊悚电影《冷瞳》，在片中饰演内敛、端庄的富豪千金苏雨辰；12月，与袁咏仪、邱心志等合作主演爱情片《有招没招之爱情达人》 ；12月10日，主演由向灼执导的推理网剧《Xgirl》播出，在剧中饰演“人体测谎机”孙小美；12月13日，与汪东城、陈汉典等合作主演的时尚喜剧电影《我的美丽王国》上映，在片中饰演天资聪颖、内心纯真的模特周若童。

2014年3月，主演由钱升玮执导的东方爱情魔幻电影《非狐外传》，在片中饰演容貌出众，身份成谜的仙儿；6月，与郑伊健、王菀之合作主演爱情电影《不再说分手》，在片中饰演阿森的“永远对小姐”小岚；8月，主演由车径行执导的现代都市情感电影《我想结婚的时候你在哪》，在片中饰演婚纱设计师苏菲。

2015年2月，与古天乐、张翰等合作出演侦探喜剧电影《神探驾到》；9月，与郑中基、雨侨合作出演喜剧电影《猛龙特囧》；12月，与陈乔恩、孙艺洲等合作主演爱情电影《北京时间》，在片中饰演每天周旋在各种浮华诱惑之中的王小莫女友。

2016年1月，与吴镇宇、江疏影等合作出演喜剧片《恶人报喜》；1月6日，与辰亦儒、沈建宏等合作主演现代都市灵异类网络剧《美女公寓》播出，在剧中饰演流淌着妖怪血液的长腿辣妹沈亚桐；2月，与卢颂之、童冰玉等合作主演动作片《霹雳囧花》，在片中饰演性格强势，事业心重的女拳手阿宝；7月，与郑伊健、文凯玲等合作主演爱情网络电影《我的极品女神》，在片中饰演拥有玫瑰一样艳丽外貌的机器人iGirl001，她则凭借该片获得首届亚洲新媒体电影节最佳女演员奖。

2017年，与邓丽欣、乐基儿合作主演爱情电影《女士复仇》，在片中饰演生活温馨甜蜜的女飞贼Dior；2月，与胡定欣、刘心悠等合作主演古装宫廷剧《宫心计2：深宫计》，在剧中饰演李隆基的昭仪郑纯熙；5月，与金燕玲、郑欣宜等合演主演爱情电影《29 1》，在片中饰演保持身材，严格自律的自危派林若君。

2018年1月4日，周秀娜凭借电影《29 1》，获得第六届高登电影奖华语电影最佳女主角；2月，凭借电影《29 1》，获得第37届香港电影金像奖最佳女主角的提名；9月，受邀出席第六届十大华语电影表彰典礼，获得年度女演员奖；11月，出演动作悬疑电影《反贪风暴4》；12月，与张晋、戴夫·巴蒂斯塔等合作主演动作电影《叶问外传：张天志》。

2019年4月，与黄宗泽、吴卓羲、关智斌等合作主演警匪剧《战毒》，在剧中饰演毒后汪紫琪。