1985年，周慧敏参加了新秀歌唱大赛。1986年，她参加了“香港电台业余DJ大赛”，并获得了亚军。1987年，周慧敏加入香港电台第二台担任DJ，与歌手黄凯芹搭档主持音乐节目《青春交响曲》。

1988年，周慧敏加入TVB，担任音乐节目《劲歌金曲》的主持人；同年8月25日，与林子祥、郑裕玲共同主演的爱情喜剧片《三人世界》上映，该片是周慧敏的电影处女作，她凭借该片获得了第8届香港电影金像奖最佳新演员提名；11月1日，推出个人首张同名EP唱片《周慧敏》，该唱片销量获得“金唱片”成绩。

1989年1月，获得香港电台第11届十大中文金曲最有前途新人奖优异奖；同年，担任香港电台电视部时事节目《摩登时代》的主持人。

1990年，与刘锡明、罗嘉良等联袂主演的古装武侠剧《乌金血剑》播出，该片是周慧敏出演的个人首部电视剧，她在剧中饰演活泼爽朗，好胜好强的“唐剑儿”；同年，推出个人首张音乐专辑《Vivian》，该专辑获得了白金销量。

1991年，周慧敏辞去电台工作，加盟宝丽金唱片公司，全线向歌唱和演戏发展；同年10月1日，推出音乐专辑《A Long and Lasting Love》，该专辑收录包括主打曲《天荒爱未老》在内的10首歌曲，其中《天荒爱未老》被评为劲歌金曲第四季季选金曲。

1992年3月19日，与黎明、郑则仕等合作主演的喜剧电影《痴情快婿》上映，她在片中饰演爱上反黑组警员的黑社会老大之女“马青霞”；6月1日，推出音乐专辑《Endless Dream》，该专辑收录包括《如果你知我苦衷》在内的10首歌曲；10月5日，与郑少秋、刘青云、刘松仁等共同主演的时装商战剧《大时代》首播，周慧敏扮演为人悭吝，却煮得一手好菜的“阮梅”；随后，周慧敏签约台湾福茂唱片，进军台湾市场，并于11月6日发行个人首张普通话唱片《流言》，该唱片总销量冲破30万张；同年，周慧敏被选为商业电台十大健康形象艺人。

1993年1月，周慧敏获得了日本NHK最受欢迎外国女歌手奖；1月7日，发行粤语专辑《冬日浪漫》，该专辑包括同名主打歌在内的11首歌曲；2月26日，出演的喜剧电影《风尘三侠》上映；9月，发行粤语专辑《最爱》；同年，获得劲爆女歌手大赏铜奖。

1994年，周慧敏先是在台湾举行了4场巡回演唱会，接着又在香港举行了4场“周慧敏美的化身94”演唱会；同年4月1日，发行粤语专辑《成长》；11月26日，与邵仲衡、郭耀明联袂主演的爱情电影《我爱法拉利》上映，她在片中饰演一直梦想成为歌手的“周小敏”。

1995年5月15日，发行粤语专辑《多一点爱恋》，该专辑包括同名主打歌在内的12首歌曲；11月13日，与陈锦鸿、梁艺龄、谭耀文等联合主演的民国爱情剧《刀马旦》开播，她在剧中饰演为追查藏宝图下落而潜入戏班的南方政府特务“沈玉茹”。

1996年5月2日，与黄秋生、黄子华、李婉华等共同主演的喜剧电影《金装香蕉俱乐部》上映；6月19日，发行了粤语专辑《热·敏》，该专辑由周慧敏亲自担任监制；10月8日，推出普通话专辑《时间》，该专辑包括同名主打歌在内的10首歌曲。

1997年下半年，周慧敏先后在美国大西洋城和拉斯维加斯各举行了一场告别演唱会，随后她宣布退出娱乐圈。2005年5月，周慧敏为宠物猫撰写的成长日记《我的猫儿子周慧豹》出版。

2006年5月26日，周慧敏在香港红馆举行了复出演唱会——“周慧敏Back For Love演唱会”；7月11日，应古巨基邀请，周慧敏在由对方执导的MV《爱得太迟》中担任女主角，并与古巨基合唱了歌曲《爱得太迟》，该曲目在2006香港新城劲爆颁奖典礼上获得了新城劲爆卡拉OK歌曲奖。

2010年8月26日，与吴君如领衔主演的爱情电影《得闲炒饭》上映，她在片中饰演因一夜情怀孕的银行职员“Anita”。

2011年3月19日，为庆祝入行25周年，周慧敏在香港红馆举行“Deep V.25演唱会”；3月28日，推出EP专辑《盆栽》；11月4日，周慧敏获得了“十大杰出衣着人士”奖。

2012年3月24日，周慧敏现身黄凯芹“true colors 25周年”演唱会担任嘉宾；5月19日，周慧敏在澳门金光综艺馆举行“Journey Of Love周慧敏世界巡回演唱会”；10月27日，“Journey Of Love周慧敏世界巡回演唱会”广州站开幕。

2014年8月15日，与宋芸桦、赖雅妍、蓝心湄等联袂主演的爱情喜剧片《等一个人咖啡》上映，周慧敏在片中扮演美丽优雅，不食人间烟火的老板娘；12月18日，推出个人首张福音专辑《HIM》，专辑收录了10首歌曲，都由周慧敏亲自监制、创作。

2015年3月21，应林以诺牧师邀请，周慧敏参加了“Yeah Show2015音乐布道会”，并演唱了福音歌曲《肋骨》。2017年1月28日，周慧敏参加了2017江苏卫视春节联欢晚会，与古巨基合唱了歌曲《许愿》。

2018年1月26日，为庆祝入行30周年，周慧敏在香港红馆举行“一万天荒爱未老·周慧敏30周年演唱会”。2019年8月10日，“一万天荒爱未老·周慧敏30周年演唱会”台北站开唱；11月9日，“一万天荒爱未老·周慧敏30周年演唱会”南宁站开唱。